DETECCIÓN DEL CÁNCER DE PRÓSTATA A TRAVÉS DE LA IDENTIFICACIÓN DE BIOMARCADORES Y USO DE MÉTODOS INSTRUMENTALES PARA EL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA ENFERMEDAD

844-2019 CONVOCATORIA PACTO PARA LA GENERACIÓN DE NUEVO CONOCIMIENTO A TRAVÉS DE PROYECTOS DE INVESTIGACION

MINCIENCIAS

• Grupo de Investigación GISM
• Director: PhD. Cristhian Durán
• Universidad de Pamplona

La siguiente etapa consiste en el análisis e identificación de los COVs o Biomarcadores mediante métodos analíticos instrumentales GC-MS para las muestras gaseosas (aliento y orina) y el perfil metabólico mediante resonancia magnética nuclear para el caso de las muestras líquidas (Orina). A partir de los COVs obtenidos la idea es identificar los compuestos o biomarcadores más sobresalientes tanto de los controles como los de Cáncer de Próstata (CaP).

Para el análisis de las muestras recogidas en Uronorte S.A, las muestras recogidas en los tubos pre-concentradores (aliento y orina) serán expuestas a una temperatura de entre 150-200 ºC para extraer los COV’s absorbidos por el Tenax. Una vez el material se someta a estas temperaturas de desorción, los compuestos serán medidos por medio de los equipos analíticos donde los cromatogramas adquiridos serán comparados con librerías de referencia de metabolitos del Instituto Nacional de Estándares (NIST) con el objetivo de identificar los biomarcadores de cáncer de próstata mediante muestras de AE.

Para el caso de las muestras de orina se utilizarán un espectrómetro de RMN, donde la muestra será acondicionada previamente con adición de una solución buffer de pH según el protocolo descrito definido en el transcurso de la ejecución del proyecto. Las muestras serán analizadas usando experimentos unidimensionales con presaturación para eliminar la presencia de señales de agua. Los experimentos más empleados con CPMG y NOESYP para este tipo de estudios por lo que permite obtener excelentes líneas bases. Una vez acumulados los espectros, estos serán sometidos a una cascada de tratamientos matemáticos antes de poder ser modelados. Eso incluye entre otros la referenciación, alineamiento y binning de los datos. Luego de la verificación de la calidad de estos y la eliminación de muestras divergentes (outliers) identificados por PCA, se modelarán los datos con métodos supervisados, como por ejemplo O-PLS. La interpretación de estos modelos permite postular a algunas moléculas como potenciales biomarcadores.

Análisis complementarios como STOCSY (statistical total correlation spectroscopy) ayudan a la identificación de estos compuestos.

Los biomarcadores serán identificados comparando las diferencias entre las muestras de los pacientes de CaP y las muestras del grupo de controles. Por otro lado, el análisis de las muestras del aíre de la clínica de Uronorte donde se han tomado las muestras de AE nos permitirá descartar los compuestos que provienen del exterior y no representan realmente biomarcadores de estas enfermedades. La interpretación médica de los biomarcadores identificados en este estudio será investigada a fondo para obtener nuevos conocimientos sobre el cáncer de próstata, lo que sería interesante contribuir a través de los biomarcadores el desarrollo de nuevos y efectivos medicamentos.

Con la identificación biomarcadores se desarrollarán e implementarán métodos alternativos como las narices y lenguas electrónicas, con el objetivo de discriminar las muestras obtenidas de los pacientes con cáncer de próstata y controles.

Además, se realizarán pruebas con otros tipos de sensores comerciales MOX y polímeros de material activo para comparar con los sensores de nanopartículas de oro funcionalizados, lo anterior con el objetivo de observar con cuál de ellos se obtienen mejores resultados para detección de CaP en muestras en aliento y muestras de espacio de cabeza de la orina.

El sistema a implementar está compuesto por una cámara de medida fabricada en teflón con una matriz de sensores de gases y un equipo de adquisición de datos acoplado a una fuente de voltaje de alta precisión para el funcionamiento de los sensores y almacenamiento de los datos.

Una interfaz gráfica de usuario será implementada para monitorear en tiempo real el funcionamiento del equipo y sobre todo los sensores de gases. Para la recuperación y purga de los sensores se utilizarán cilindros de aire sintético y cilindros de nitrógeno, ya que son necesarios para evacuar las partículas o compuestos del AE y de las muestras de orina volatilizada que ingresan a la cámara de medición una vez se realicen las medidas con las muestras adquiridas de los pacientes con CaP y controles.

En esta etapa se realizarán pruebas con el sistema e-nose «in-situ» en la clínica Uronorte, para comprobar el funcionamiento del sistema y sensibilidad-selectividad de los sensores ante las pruebas con pacientes con CaP y controles; para estas pruebas se utilizará el contenedor Bio-VOC, el mismo utilizado en la de recolección de muestras. Como alternativa se utilizará un sistema de desorción térmica fabricado en la Universidad de Pamplona con el objetivo de hacer pruebas con los tubos pre-concentradores y comparar con los resultados obtenidos haciendo las pruebas «in-situ». Para el caso de la generación del espacio de cabeza de las muestras de orina se usara la misma metodología expuesta en la de recolección.

Adicionalmente con las muestras de orina liquida, se implementará un Multi Potenciostato/Galvanostato el cual será utilizado como una lengua electrónica (e-tongue), ya que permite realizar medidas electroquímicas desde 1-2 canales que actúan de manera individual.

Para el censado de las muestras de orina se utilizarán electrodos serigrafiados con electrodo de trabajo compartiendo el electrodo auxiliar y otro de referencia. Los tipos de electrodos serigrafiados que serán utilizados para las pruebas con las muestras de orina son de tipo Carbono, Oro, Platino, Plata o Nanotubos de Carbono. Con el equipo y un software de análisis de señales electroquímicas se realizarán medidas con las principales técnicas Voltamperométricas y Potenciométricas para obtener una huella característica de la muestra de CaP y controles.

A través de técnicas de análisis estadísticos de datos multivariados Análisis de Componentes Principales (PCA) y Análisis de Funciones de Discriminación (DFA), se realizará la discriminación de las medidas y a su vez se utilizarán algunas técnicas para seleccionar los sensores y electrodos que nos den mejor información de las medidas obtenidas. Lo anterior conlleva a optimizar la respuesta tanto del equipo sensorial y electroquímico con el objetivo de obtener una mejor respuesta en la clasificación de las medidas.

Al final, se implementarán diferentes algoritmos de inteligencia artificial y clasificadores como las redes neuronales Red Perceptrón Multicapa (MLP), Probabilísticas (PNN), de base Radial (RBF) y otras que nos puedan dar mejor clasificación de los casos de CaP y controles con la E-nose y E-tongue. El algoritmo de Máquinas de Soporte vectorial (SVM) será implementado como clasificador alternativo y de esta forma determinar la mejor respuesta y tasa de acierto en la clasificación. Al final se tendrá respuesta en sensibilidad, especificidad y exactitud de cada uno de los dos instrumentos analíticos y la identificación de biomarcadores con equipos estándar.

Productos esperados:

Ponencias nacionales e internacionales, formación de estudiantes de maestría y doctorado, Jóvenes investigadores, Artículos de investigación en revistas indexadas, difusión de información y patente.